目录：
1、由烟粉虱传播的桂花黄化曲叶病毒病和桂花褪绿病毒病严重危害桂花产业的发展
2、桂花被TYLCV侵染后
3、1998年在美国佛罗里达州首次发现了桂花褪绿病毒
4、PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测拍照
5、PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测拍照
6、双重PCR检测ToCV和TYLCV以ToC6反转录得到的cDNA和提取的叶片DNA为模板
7、PCR反应条件
8、疑似复合感染ToCV和TYLCV的桂花植株
桂花是我国重要的经济作物,在全国各地都有种植,省随着种植结构的调整,种植面积逐渐增大。
由烟粉虱传播的桂花黄化曲叶病毒病和桂花褪绿病毒病严重危害桂花产业的发展
近几年,的由烟粉虱传播的桂花黄化曲叶病毒病和桂花褪绿病毒病严重危害桂花产业的发展。
桂花被TYLCV侵染后
桂花被TYLCV侵染后,分子植株生长缓慢甚至停滞,传播顶部叶片皱缩发黄,叶边缘上卷。桂花植株早期感染该病毒会影响正常开花结果;后期感染则导致结果少且果实小,病毒鉴定桂花树价格严重影响桂花的产量和品质,桂花黄化曲叶病毒病给世界许多地区的桂花生产带来毁灭性灾害。ToCV和TICV属于长线形病毒科毛形病毒属。
1998年在美国佛罗里达州首次发现了桂花褪绿病毒
1998年在美国佛罗里达州首次发现了桂花褪绿病毒,树随后意大利、巴西、以色列、中国等地也有相继报道。桂花被ToCV侵染后,叶片褪绿、黄化,尤以植株下部叶片叶脉浓绿,病毒病脉间褪绿、黄化最为明显,貌似缺素症。在自然条件下,省ToCV主要通过烟粉虱传播,侵染茄科、番杏科、苋科、夹竹桃科、藜科、菊科和蓝雪科等植物,桂花不能通过摩擦接种的方式侵染植物。近年来,由于全球气候变暖及保护地蔬菜面积增加,烟粉虱在全世界扩散与爆发,由烟粉虱传播的桂花病毒病给桂花生产造成了巨大损失。目前,防治由烟粉虱传播的桂花病毒病最有效的方法是种植抗病品种。笔者主要通过分子生物学技术,桂花树利用TYLCV、ToCV和TICV的特异性引物,对河南省桂花主栽区的疑似样品进行检测,河南省并建立一套快速的烟粉虱传播的桂花病毒病检测体系,为桂花病毒病的综合防治提供技术支持。待测桂花样品2016年9月在郑州、中牟、新郑和济源的桂花大棚中采集叶脉褪绿,河南分子叶片边缘卷曲、皱缩、褪绿黄化的桂花叶片-80℃低温保存备用。生化试剂RNA提取试剂TRIzol购自Invitrogen公司;RTaseM-MLV和RNaseInhibitor购自Promega公司;TaqDNA聚合酶、凝胶回收纯化试剂盒和DL2000DNAMarker均购自杭州博日科技有限公司;dNTPs和T4DNALigase购自TaKaRa公司;其他生化试剂和化学试剂均为分析纯。菌株、阳性对照和克隆载体大肠杆菌DH5α菌株与TYLCV、ToCV阳性对照由郑州市蔬菜生物技术重点实验室保存,克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司。样品总RNA提取及RT-PCR称取桂花叶片约0.1g加入液氮研磨成粉末,按照TRIzol法提取植物总RNA,用于cDNA的合成。反转录体系:总RNA5.0μL,dNTPMix1μL,传播树ToCV和TICV下游引物ToC-6、TICVR1.0μL,RNase-FreeH2O3μL,病毒70℃变性10min,立即冰上放置2min,再加入5×M-MLVBuffer5μL,价格200U·μL-1RTaseM-MLV1.0μL,病毒病40U·μL-1RNaseInhibitor0.5μL,烟粉虱RNase-FreeH2O8.5μL,37℃水浴60min。PCR反应体系如下:cDNA5.0μL,省Taq酶1μL,ToC-5/ToC-6引物各1μL,桂花10×buffer2.5μL,桂花树dNTPMix1μL,鉴定ddH2O13.5μL。扩增条件:94℃3min;94℃30s,的56℃45s,病72℃1min,河南桂花树35个循环;72℃10min。根据PannoS等报道,桂花侵染性褪绿病毒的检测应用TICVF/TICVR特异性引物,PCR反应体系同ToCV,扩增条件:94℃5min;94℃30s,50℃30s,72℃30s,40个循环;72℃10min。
PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测拍照
PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测拍照,病毒桂花树价格并经胶回收试剂盒纯化后,将PCR产物克隆到pMD18-T载体,树阳性克隆经验证后送北京三博远志生物技术有限公司测序。植物总DNA提取及TYLCV检测称取0.1g桂花叶片样品,加入液氮充分研磨成粉末,病毒病参照CTAB法提取桂花叶片总DNA,用于后续试验。桂花黄化曲叶病毒检测采用TYLCV特异性引物TYLCV-CPF/TYLCV-CPR扩增,PCR反应体系如下:模板DNA1.0μL,价格Taq酶0.5μL,TYLCV-CPF/TYLCV-CPR引物各1μL,10×buffer2.5μL,dNTPMix1μL,鉴定ddH2O19μL。扩增条件:94℃3min;94℃30s,55℃45s,72℃1min,桂花树35个循环;72℃10min。
PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测拍照
PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测拍照,并经胶回收试剂盒纯化后,将PCR产物克隆到pMD18-T载体,阳性克隆经验证后送北京三博远志生物技术有限公司测序。各引物序列详见表1。
双重PCR检测ToCV和TYLCV以ToC6反转录得到的cDNA和提取的叶片DNA为模板
双重PCR检测ToCV和TYLCV以ToC6反转录得到的cDNA和提取的叶片DNA为模板,ToC5/ToC6和TYLCV-CPF/TYLCV-CPR为引物,进行PCR扩增。PCR反应体系:10×PCR反应缓冲液5μL,烟粉虱dNTPs1.0μL,ToC5/ToC6和TYLCV-CPF/TYLCV-CPR引物各1.0μL,分子Taq酶1.0μL,传播cDNA模板1.0μLDNA5.0μL,加ddH20至体积50μL。
PCR反应条件
PCR反应条件:94℃预变性3min,病毒94℃变性45s,53℃复性45s,72℃延伸1min,价格30个循环,河南72℃延伸10min。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测拍照。序列比对分析利用NCBI序列比对工具BLAST分析克隆获得4个样品的ToCVHSP70h部分序列和TYLCVCP的序列,根据相似性确定病毒种类,并与国际上报道的ToCVHSP70h与郑州分离物和TYLCV郑州分离物进行序列相似性分析。
疑似复合感染ToCV和TYLCV的桂花植株
疑似复合感染ToCV和TYLCV的桂花植株,省在抗TYLCV品种上表现为叶片沿叶脉褪绿变黄,叶片变脆,传播有坏死斑点等典型的ToCV症状;在感TYLCV品种上表现叶片边缘黄化、皱缩、叶片增厚和植株矮化等典型的TYLCV症状。桂花疑似病株的分子检测对在4个地区采集的疑似病株样品分别提取RNA和DNA,采用ToCV和TICV的特异性引物对样品进行RT-PCR扩增,鉴定所有样品中,ToCV特异性引物均扩增出460bp左右的特异性条带,病TICV特异性引物未扩增出目的条带;采用TYLCV的特异性引物TYLCV-CPF/TYLCV-CPR进行PCR扩增,4个地区样品中均扩增到约780bp左右的条带(图,序列比对分析表明,病毒病4个地区样品ToCVHSP70h和TYLCV外壳蛋白基因核苷酸序列与这2种病毒的郑州分离物同源性均在99%以上。结果表明,4个地区的检测样品均被ToCV和TYLCV复合侵染。以ToC6反转录得到的cDNA和提取的叶片DNA为模板,分子ToC5/ToC6和TYLCV-CPF/TYLCV-CPR为引物,进行PCR扩增,桂花每个样品中均扩增得到460bp和780bp左右的条带(图,表明采用双重PCR可以通过1次PCR反应完成对2种烟粉虱传播的病毒病的分子检测。近年来,桂花黄化曲叶病毒病已经成为河南地区桂花产区的普发病害。目前,种植桂花抗病品种是控制桂花黄化曲叶病毒病最安全、有效的途径。烟粉虱传播的桂花黄化曲叶病毒病、桂花褪绿病毒病以及桂花黄化曲叶病毒病和桂花褪绿病毒病复合侵染的分子鉴定已有报道,笔者为了提高检测效率,河南通过对PCR反应体系和条件的优化,建立了一套检测TYLCV、ToCV和TICV3种病毒复合侵染的方法。TICV侵染桂花后的症状与ToCV相似,河南省笔者运用TICV的特异性引物对样品进行RT-RCR,价格所有样品均未扩增出目的条带,说明样品未受到TICV侵染,用TYLCV和ToCV特异性引物扩增,所有样品均扩增出目的条带,且与这2种病毒郑州分离物的核苷酸序列同源性均在99%以上,说明样品均受到TYLCV和ToCV侵染。但是,传播在实际生产中种植的抗TYLCV桂花品种是否对ToCV表现抗病,或者是易被ToCV侵染,鉴定还需进一步研究。TYLCV和ToCV在国内首次报道发生以来,已经成为国内各个地区危害桂花生产的主要病害。笔者利用分子生物学技术,对河南4个地区桂花疑似该2种病毒侵染的叶片样品进行检测,均检测到TYLCV和ToCV,属于复合侵染,烟粉虱桂花这也是在河南首次明确桂花受到桂花褪绿病毒和桂花黄化曲叶病毒的复合侵染。