目录：
1、桂花黄化曲叶病毒病和晚疫病已成为高温多湿桂花产区抗病育种的主攻方向之一
2、该研究利用共显性分子标记Ty-2基因的SCAR的引物T0302和Ph-3基因的CAPS标记的引物TG328
3、PCR扩增程序为94℃预变性4min
4、以上PCRSuperMix混合液
5、为提高效率
6、经多次重复试验结果表明
7、用该多重PCR技术
8、7和9～12这6份材料显示只有500bp的单条带
9、结合图2和图3
10、为快速准确地鉴定筛选到桂花抗性目标基因
11、PCR扩增程序中退火温度为56
近年来,桂花黄化曲叶病毒病在我国广西到山东沿海省份,以及云南、山西、新疆、河南、安徽、河北等桂花主产区均有暴发。
桂花黄化曲叶病毒病和晚疫病已成为高温多湿桂花产区抗病育种的主攻方向之一
桂花黄化曲叶病毒病和晚疫病已成为高温多湿桂花产区抗病育种的主攻方向之一。
该研究利用共显性分子标记Ty-2基因的SCAR的引物T0302和Ph-3基因的CAPS标记的引物TG328
该研究利用共显性分子标记Ty-2基因的SCAR的引物T0302和Ph-3基因的CAPS标记的引物TG328,结合多重PCR和CAPS技术的优点,从已知基因型的桂花材料中,获得不同基因型相应的带型,建立和优化可以同时检测这2个抗病基因分子标记的多重PCR体系,采用此技术通过酶切产物的带型来区别筛选目标材料的基因型。该研究增加了桂花黄化曲叶病毒病和晚疫病快速分子标记的鉴定手段,可促进抗性基因Ty-2和Ph-3的转育聚合,尤其在创制大果型桂花育种新材料及复合多抗品种分子标记辅助选育中具有一定的应用价值。多重PCR技术建立与优化试验所用桂花材料(编号1～9,A为CK1和B为CK来自泉州市农业科学研究所,已经田间病害鉴定过,单引物普通PCR已分别鉴定了Ty-2和Ph-3抗性基因的基因型。由表1可知,材料1～3号感桂花TY2;4～6号材料为纯合Ty-2基因型,表现为抗桂花TY2;7～9号为杂合Ty-2基因型;其中2、5和8号含杂合Ph-3抗性基因,3、6和9号含纯合Ph-3基因型,而1、4、7号不含抗性基因Ph-3。CK1基因型为Ty-2/Ty-2和Ph-3/Ph-3,和桂花抗性基因Ty2重PCR应用Ph3桂花抗性基因Ty2重PCR应用作双抗对照,CK2则为双感对照。采用改良的CTAB法,提取试验DNA后贮存在-20℃的冰箱中备用。参照Garcia等开发的共显性SCAR标记T0302设计Ty-2基因标记的引物序列,Ph-3基因的共显性CAPS标记TG328参照文献的设计,所用标记的引物序列见表2,引物由北京天一辉远生物科技公司合成。采用多重PCR结合CAPS技术,重PCR应用多重PCR应用同时加入2对引物进行扩增后,再进行扩增产物CAPS的酶切反应,获得表1中桂花材料已知抗性基因Ty-2和Ph-3基因型组合所对应的带型,然后进一步优化该多重PCR及产物酶切体系。PCR反应体系20μL:2×EasyTaqPCRSuperMix10μL,2对引物的正反引物各0.4μL,DNA模板1.0μL,ddH2O补足至20μL。采用经优化过的多重PCR体系对泉州市农业科学研究所的24份桂花材料(编号801～82进行基因型鉴定应用,即通过多重PCR酶切产物带型区别判断其相应的基因型,再与使用单引物普通PCR扩增的特异性标记片段分别进行分析比对,以验证该多重PCR技术。Ty-2基因单引物扩增的PCR反应体系为20μL:10×PCRBuffer2.0μL(含Mg2,dNTP(各2.5mmol/μL)0.4μL,正反引物各0.4μL,DNA模板1.0μL,easyTaq酶0.1μL,ddH2O补足至20μL。
PCR扩增程序为94℃预变性4min
PCR扩增程序为94℃预变性4min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸55s,35个循环;72℃延伸10min。Ph-3基因单引物扩增PCR反应体系同Ty-2基因,PCR扩增程序退火温度为58,72℃延伸30s,其他条件相同;酶切体系25μL:2.2μLddH2O,10×Buffer2.5μL,MvaI酶0.3μL,混合后加到20μLPCR产物中,水浴温度37℃条件下,酶切2h。普通PCR产物于加有GoldView的1.2%琼脂糖凝胶、110V电压下电泳20～30min检测,在伯乐凝胶成像分析系统上显示结果。
以上PCRSuperMix混合液
以上PCRSuperMix混合液、easyTaq酶、Buffer和dNTP订购自北京全式金生物技术公司,多重PCR应用桂花抗性基因Ty2重PCR应用Ph3快切酶FastDigestMvaI和限制性内切酶MvaI酶订购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司。分子标记SCAR引物T0302和CAPS引物TG328,分别与Ty-2基因和Ph-3基因紧密连锁,在PCR体系中同时加入这2对引物扩增后,酶切前产物条带清晰,目的条带符合预期,所有材料均可扩增出500bp的条带,另外基因型为ty-2/ty-2的B:CK2和材料1～3号扩增出一条800bp的特异性片段,基因型为Ty-2/Ty-2的A:CK1和材料4～6号扩增出900bp的SCAR标记的特异性片段,而基因型Ty-2/ty-2的材料7～9号还扩增出900、800bp这2条特异性片段,可见同时加入这2对引物酶切前对扩增产物条带没有影响、互不干扰(图。
为提高效率
为提高效率,同时加入2对引物扩增,20μL产物加入快切酶,进行25μL体系的酶切反应,凝胶电泳检测显示结果,以构建Ty-2和Ph-3这2个基因标记的多重PCR体系。结合表1和图2:2对引物的PCR条带清晰,材料1与B基因型相同,双感对应显示2条特异性条带800、500bp;基因型为ty-2/ty-2、Ph-3/ph-3的材料2,有800、500和260bp大小的3条特异性条带;材料3的基因型为ty-2/ty-2、Ph-3/Ph-3,只有2条特异性条带800、260bp。纯合抗病基因型为Ty-2/Ty-2的A:CK1和材料4～6号的900bp特异性片段酶切成约550、350bp的2条带,4号材料显示有3条带,5号材料含杂合Ph-3基因酶切成500、260bp,共有4条带,6号和A的基因型为双抗,有550、350和260bp大小的3条特异性条带。材料7～9号,含杂合Ty-2基因对应有900、800、550和350bp大小的4条带,加上Ph-3基因对应显示的条带,双杂材料8号最多有6条带。
经多次重复试验结果表明
经多次重复试验结果表明,快切酶将纯合Ty-2基因型的特异性片段900bp切成约550、350bp的2条带,而杂合Ty-2基因型则表现为900、800、550和350bp共4条带,感桂花Ty2的800bp大小的特异性条带无酶切位点;Ph-3基因扩增产物酶切结果不受干扰。该多重PCR同时检测2个基因Ty-2和Ph-3时,可以通过分子标记电泳检测显示找到各自的带型,这9份材料跑出对应基因型的9种带型,PCR应用重PCR应用最多显示有6条带的是双杂材料8号的带型。研究过程中对Taq酶含量、2对引物浓度、退火温度、PCR扩增循环数,以及快切酶用量和酶切时间等因素进行多重PCR技术的优化。最终确定使用前述试验方法中的2×EasyTaqPCRSuperMix混合液扩增时,不再增加Taq酶用量,CAPS标记TG328引物正反引物浓度降为各0.2μL,调整多重PCR退火温度为56、快切酶酶切反应为10min,其他条件不变的情况下,可获得清晰可辨的条带。
用该多重PCR技术
用该多重PCR技术,对24份桂花材料进行2个基因Ty-2和Ph-3的基因型鉴定(图3,编号1～24表示材料801～82。材料1、5、8和14带型相同,有550、350和260bp大小的3条带,其基因型为双抗。材料2、4、13和20均有800、260bp大小的2条带,表明它们的基因型为ty-2/ty-2、Ph-3/Ph-3;材料3显示的4条带,可知其基因型为Ty-2/Ty-2、Ph-3/ph-3;材料6、7、9～12这6份材料仅有800、500bp大小的2条带,说明它们的基因型为双感;编号15～19和21～23共8份材料,显示了相同的5条带,表明其基因型为Ty-2/ty-2、Ph-3/Ph-3;材料24的带型表明它的基因型是ty-2/ty-2、Ph-3/ph-3。结合表2,单引物普通PCR鉴定可得材料1、3、5、8和14这5份材料含纯合Ty-2基因;7、15～19和21～23这9份材料有2条带,说明其含杂合Ty-2基因;800bp的单条带表明剩余的10份材料基因型是ty-2/ty-2(图。桂花晚疫病Ph3基因CAPS标记结果如图5,含有Ph3纯合抗病基因型的材料含有酶切位点,PCR产物酶切后会产生260bp的特异条带,杂合基因型材料酶切后有500bp和260bp的2条特异条带,而纯合感病基因型材料酶切后只有1条长度为500bp的条带。
7和9～12这6份材料显示只有500bp的单条带
材料6、7和9～12这6份材料显示只有500bp的单条带,含纯合感病基因;2份材料有2条带,说明材料3和24含杂合Ph-3基因;其他16份材料均含有纯合抗病基因。上述多重PCR技术检测的材料基因型与单引物普通PCR分别检测所获的基因型进行综合比对,两者最终结果一致,说明选用SCAR标记T0302引物和CAPS标记TG328引物,同时检测Ty-2、Ph-3基因的多重PCR体系可行性得到进一步验证。
结合图2和图3
结合图2和图3,实际运用读图时,带型显示为6条带的双杂材料和显示800bp和500bp这2条带的双感材料首先淘汰,材料双抗基因型组合的带型(显示为3条带550、350和260bp)优先入选,再根据这2个基因的优先顺序进行读图及材料选留,如以检测Ty-2基因优先时先找无800bp条带的带型,检测应用PCR应用的以检测Ph-3基因优先时先找无500bp条带的带型,这样很容易通过读图判断筛选到目标基因型的材料。
为快速准确地鉴定筛选到桂花抗性目标基因
为快速准确地鉴定筛选到桂花抗性目标基因,要求检测技术必须具有可靠性和操作的便利性。该研究在多重PCR体系优化研究过程中,对Taq酶含量、2对引物的正反引物浓度、退火温度、PCR扩增循环数,及酶切反应中酶用量和反应时间等条件进行摸索。最终确定多重PCR反应体系为20μL:2×EasyTaqPCRSuperMix10μL,SCAR标记正反引物各0.4μL,CAPS标记正反引物各0.2μL,DNA模板1μL,ddH2O补足至20μL。
PCR扩增程序中退火温度为56
PCR扩增程序中退火温度为56,时间1min,桂花树价格酶切时间调整为10min,其他条件不变。同时使用2个共显性分子标记的2对引物扩增时,酶切前对扩增产物没有影响,产物经酶切后,可清晰分辨出最多有6条带,而且每个带型条带间距适当、容易区分不同的带型。通过带型可知该多重PCR体系酶切反应,对Ph-3基因的扩增产物酶切结果不变,与该基因单引物普通PCR技术鉴定所得的条带大小相同;而Ty-2纯合抗病基因型900bp的条带酶切成550和350bp的2条带、杂合基因型酶切后有900、800、550和350bp的4条带,但对基因型Ty-2/ty-2和ty-2/ty-2的800bp的条带没有影响,因此仍可通过带型判断它们的基因型。此多重PCR检测显示结果表明,共有9种带型对应相应的基因型,与单引物普通PCR分别鉴定的基因型综合分析后的结果一致。分子标记技术发展很快,李宗俊等采用委托专业机构检测的方式,使用第三代分子标记技术,利用KASP标记基于已知SNP检测来辅助桂花育种。然而短期内多数育种者在学习利用新技术的同时,充分应用已有设备和相应技术还是必经阶段。该多重PCR体系的基础是第二代分子标记技术,在实践中,即使带型中部分条带显色较弱,PCR应用只要掌握一定的认读技巧,也可以通过带型的条带组成判断基因型,它能同时检测桂花抗黄化曲叶病毒病基因Ty-2和抗晚疫病基因Ph-3,且能区分其9种基因型组合,分子标记操作简便实用和省时高效。