目录：
1、McAPX2启动子的分离根据桂花树McAPX2的全长cDNA序列
2、McAPX2生物信息学分析由在线软件ORFFinder寻找McAPX2最大开放阅读框
3、荧光定量PCR分析以稀释10倍的反转录cDNA为模板
4、采用TargetP1.1对McAPX2蛋白进行细胞内定位预测
5、桂花树McAPX蛋白与葫芦科植物甜瓜
6、采用实时定量PCR技术分别检测McAPX2在桂花树开花初期不同组织器官的表达情况
7、将启动子PCR扩增产物克隆到pMD18-T载体上
8、本试验从桂花树叶片均一化文库中克隆出1086bp的McAPX2全长cDNA序列
9、Park等研究发现
10、对于特定处理条件下
低温胁迫打破植物细胞内活性氧产生和消除的平衡机制,造成活性氧含量大幅增加,引发氧化胁迫,致使植物生长发育受阻,甚至死亡。
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McAPX2启动子的分离根据桂花树McAPX2的全长cDNA序列
McAPX2启动子的分离根据桂花树McAPX2的全长cDNA序列,从起始密码子下游200bp内设计巢式引物A2GSP-1,A2GSP-2和A2GSP-3。参照刘志钦等方法和GenomeWalkingkit试剂盒说明书,以纯化的桂花树‘24-K’基因组DNA为模板,进行3轮巢式PCR,分离克隆McAPX2上游调控区域的启动子序列。PCR产物纯化回收并克隆至pMD18-T载体上,委托上海英骏生物技术公司测序。
McAPX2生物信息学分析由在线软件ORFFinder寻找McAPX2最大开放阅读框
McAPX2生物信息学分析由在线软件ORFFinder寻找McAPX2最大开放阅读框,使用Blastn进行同源性分析;采用Maga5.01软件绘制系统进化树;利用在线软件Blastp、SOSUI、Signal3.0、TMHMM、TargetP1.1、SOPMA等分析McAPX2编码的氨基酸序列、蛋白结构、疏水性、跨膜结构、磷酸化位点等。利用在线软件PlantCARE预测其顺式作用元件。
荧光定量PCR分析以稀释10倍的反转录cDNA为模板
荧光定量PCR分析以稀释10倍的反转录cDNA为模板,根据McAPX2基因序列设计荧光定量引物McAPX2-RT-F/R,以桂花树环素基因作为内参基因,以McCYP-RT-F/R为荧光定量引物(表,RT-qPCR分析在ABI7500荧光定量PCR仪上进行,每个样品进行3次重复。20μLPCR扩增体系为:10μL2×RealMasterMix混合液、5～10ngcDNA、上下游引物各0.5μL,补ddH2O至20μL。反应程序为:95℃预变性10min;94℃15s,60℃34s,40次循环,清水模板为阴性对照。采用2△Ct法计算相对表达量。原始数据用Excel2007软件处理,用SPSS10.0软件进行相关分析。从桂花树叶片均一化文库中克隆得到1个APX相关的EST片段,去除引物和载体片段,经blastn比对分析,发现与黄瓜L-ascorbateperoxidase的cDNA序列相似性为67.5,经测序及序列分析,得到APX基因cDNA全长序列(图1,该序列全长为1086bp,包括89bp的5-UTR,250bp的3-UTR。起始密码子ATG附近有Kozak保守序列"A/GCCATGG,cDNA末端含有PolyA序列,及其启动子克隆基因克隆在PolyA之前20bp含保守加尾信号"TGTAA"序列,这些均符合能有效翻译基因的全长cDNA特征,命名为McAPX2,GenBank登录号为KJ722767.1。经ORFFinder分析,McAPX2的开放阅读框为747bp,编码249个氨基酸。ProtParam软件分析表明,克隆表达与克隆表达McAPX2蛋白分子式为C1236H1912N326O365S5,相对分子量27.34ku,理论等电点pI为5.43;负电荷残基为36个,正电荷残基为28个;脂肪系数为83.90,平均熟疏水性为-0.280;不稳定指数为34.80,属于稳定蛋白。经ProtScale软件推测该蛋白为亲水性蛋白。
采用TargetP1.1对McAPX2蛋白进行细胞内定位预测
采用TargetP1.1对McAPX2蛋白进行细胞内定位预测,结果显示定位在线粒体内或分泌到胞外的可能性较小,极有可能在其它部位。经SignalP4.1Server软件分析,McAPX2蛋白不含信号肽,不是分泌蛋白。经TMpred程序分析,McAPX2蛋白不含跨膜区域。结果推测McAPX2蛋白定位在细胞质中。经SOPMA预测McAPX蛋白二级结构显示,McAPX蛋白包含有104处α-螺旋,占41.77;22处β-转角,占8.84;25处延伸链,占10.04;98处无规则卷曲,占39.36。通过NCBI的CDS软件分析,McAPX2蛋白属于植物来源的过氧化物酶超家族,该蛋白含有1个过氧化物酶活性位点或底物结合位点区域,1个亚铁血红素配基结合区域或血红素结合位点,发现7个与形成二聚体静电作用相关的保守氨基酸。利用DNAMAN软件进行氨基酸同源比对(图,发现APX蛋白序列C-端高度保守,N-端相对不保守,与同属的甜瓜、黄瓜、南瓜、桂花树同源性分别为95,94,94,93,说明葫芦科APX氨基酸序列具有较高的保守性。利用MEGA5.0软件,将McAPX2蛋白与其他27种植物的APX蛋白进行系统发育树构建(图,参与构建进化树的27个APX蛋白已被证明或预测定位于细胞质中。
桂花树McAPX蛋白与葫芦科植物甜瓜
结果显示,桂花树McAPX蛋白与葫芦科植物甜瓜、黄瓜的APX蛋白亲缘关系最近,与茄科的番茄、烟草和辣椒的APX具有相对较近的亲缘关系,与克隆表达启动子克隆的与豆科的大豆、苜蓿、豇豆等的APX蛋白亲缘关系相对较远,而与无患子科植物柚和龙眼的APX亲缘关系最远。结果表明,桂花树McAPX2基因与其它植物的APX具有较高的保守性,这些APX蛋白功能在进行化上保守,推测McAPX2蛋白定位于细胞质中。
采用实时定量PCR技术分别检测McAPX2在桂花树开花初期不同组织器官的表达情况
采用实时定量PCR技术分别检测McAPX2在桂花树开花初期不同组织器官的表达情况,以叶片中相对表达量为1。从图5可见,McAPX2在根、茎、叶、雌花和授粉5d幼果等器官中的表达量存在极显着的差异。在根、茎、幼果中大量表达,其中根的表达量最大,而在叶片中的表达量最低。采用实时定量PCR技术检测在低温胁迫下桂花树初花期叶片中McAPX2表达情况,以对照处理McAPX2相对表达量为1。结果发现,低温胁迫处理1h时,桂花树叶片McAPX2表达量与对照处理McAPX2表达量无显着差异;低温处理3h时McAPX2表达量有显着的上调趋势;低温处理6h时,McAPX2表达量是对照处理的16倍;低温处理12h时McAPX2表达量达到最大,是对照处理表达量的23倍;低温处理24h时,McAPX2表达量降低,仍比对照处理的表达量高17倍(图。
将启动子PCR扩增产物克隆到pMD18-T载体上
将启动子PCR扩增产物克隆到pMD18-T载体上,经酶切鉴定、测序,McAPX2基因克隆桂花树基因克隆获得序列片段长为1276bp(图。结果发现,所获得的序列3′端116bp序列与McAPX2cDNA的5′端序列比对一致,表明所得序列为McAPX2基因上游的启动子区域。使用在线neuralnetworkpromoterprediction软件预测出转录起始点为T,位于起始密码子上游214bp处;采用在线软件PlantCare分析,在转录起始位置上游30bp位置预测到1个TATA-BOX,在上游68bp位置预测到1个CAAT-BOX。发现该段序列上含有植物激素响应元件,如赤霉素响应元件GARE1OSREP1、赤霉素反应瞬时作用元件PYRIMIDINEBOXOSRAMY1A、脱落酸响应元件ABRE、乙烯响应元件ERELEE4和细胞分裂素响应元件ARR1AT;器官特异表达元件,如根器官特异表达元件ROOTMOTIFTAPOX1、花粉特异表达元件POLLEN1LELAT52;病原菌响应元件,如ASF1MOTIFCAMV、ELRECOREPCRP1、WBOXATNPR1;防御与胁迫响应元件,如DOFCOREZM、WBBOXPCWRKY1;光调控元件BOX4;逆境响应元件,如干旱诱导元件,如MYB1AT、MYB2CONSENSUSAT、MYBCORE,干旱和黑暗响应元件ACGTATERD1,热激盐诱导表达GT1GMSCAM4,低温诱导响应元件LTRE1HVBLT49(图。
本试验从桂花树叶片均一化文库中克隆出1086bp的McAPX2全长cDNA序列
本试验从桂花树叶片均一化文库中克隆出1086bp的McAPX2全长cDNA序列,该基因编码含有249个氨基酸的完整开放阅读框。保守区分析发现该基因所编码的蛋白属于植物POD超家族,具有过氧化物酶活性位点和亚铁血红素配基结合区等与其他物种APX相同的保守域。在高等植物中APX是编码多基因家族,APX蛋白根据不同细胞定位可划分4种同工酶:叶绿体基质及类囊体膜APX,线粒体膜APX、过氧化物酶体和胞质APX。4种APX同工酶的分子量、亚细胞定位、结构和序列存在差异。McAPX2蛋白分子量为27.43ku,与拟南芥胞质型AtAPX1/2分子量27.5ku相当。该蛋白含有7个参与二聚体界面静电作用的保守带电残基,说明McAPX2可能和拟南芥胞质型AtAPX1/2一样以二聚体结构存在。亚细胞定位预测发现该蛋白序列的N-端不含信号肽,克隆分析克隆表达表明该蛋白不定位叶绿体或线粒体上,C-端不含跨膜区域,表明不定位在过氧化物酶体上,推测可能定位在细胞质。同源比对发现,该蛋白与同科植物甜瓜,黄瓜和南瓜的cAPX有很高的同源性;系统聚类树分析显示,McAPX2与其它27种植物的cAPX具有较高的同源性,说明该基因家族在进化上十分保守。由此可以推断获得的桂花树McAPX2基因属于APX基因家族的cAPX基因亚族。目前许多高等植物中不同类型的APX基因被克隆出来,有研究表明,APX基因的表达受各种环境胁迫因子的诱导。APXs,桂花树价格尤其是cAPX更有助于使植物免受氧化应激作用。
Park等研究发现
Park等研究发现,甘薯受伤害胁迫诱导后APX表达量明显上调;Koussevitzky等发现干旱和热激胁迫后拟南芥APX1的mRNA和蛋白质表达量达到最高;王超等发现盐胁迫处理诱导白桦APX基因显着表达;Lu等发现2种水稻cAPXs基因均可以且在不同程度上提高转基因烟草的耐盐性,其中OsAPXb基因对盐胁迫更敏感。曾秀存等发现低温胁迫诱导白菜型冬油菜cAPX基因上调表达,超强抗寒性品种‘陇油7号’APX基因表达量高于抗寒性弱的品种‘天油4号;本研究表明低温胁迫下桂花树McAPX表达量上调,与曾秀存等研究结果相一致;另外,低温胁迫诱导植株体内的APX活性上调在水稻,咖啡,山楂和辣椒中也得到了证实。然而,有研究表明,低温胁迫可诱导cAPX下调表达,Morita等发现低温处理水稻胞质型OsAPX2的表达量下调;Funatsuki等发现大豆cAPX1缺失突变株比野生型更为耐寒。cAPX基因的表达差异可能与试验材料对低温的敏感程度、试验条件和胁迫强度等相关。对于低温敏感性植物而言,低温胁迫下植物主要遭受氧化胁迫,植株体内APX活性上调,清除过量的H2O2,以利于植物在更低温度或长时间低温下生存。
对于特定处理条件下
对于特定处理条件下,低温胁迫可诱导cAPX下调表达积累H2O2,H2O2作为低温胁迫信号因子触发诱导下游防御基因的表达,表现出耐寒性。启动子作为一种顺式作用元件,是研究基因表达调控的重要因素之一。本研究通过染色体步移法从桂花树果实中分离得到McAPX2基因上游1276bp的启动子序列。通过在线软件PLACE和PlantCare分析,该序列具有启动子的普遍特征,在转录起始位置有基因转录必须的与RNA聚合酶结合或互作的保守元件TATA-BOX和CAAT-BOX,含有与GA、ABA、CTK、乙烯等激素和病原菌等生物胁迫以及热激、干旱、低温、光等非生物胁迫的相关元件,这些元件的发现说明McAPX2基因可能在转录水平上受到激素、生物胁迫和非生物胁迫等多种因素的调节。该序列上的低温诱导响应顺式元件LTRE1HVBLT49可能与低温胁迫下APX基因的差异表达有着重要关系;3个增强子元件CAATBOX、EECCRCAH1、GATABOX可能与增强启动子驱动下游McAPX2基因的表达相关。同时该序列中发现了器官特异表达元件,说明McAPX2在植物体内的表达可能具有器官特异性。McAPX2启动子各元件的具体功能还有待进一步研究验证。