由果胶杆菌Pectobacteriumspp.引起的细菌性软腐病是大桂花的三大主要病害之一,一般发生在大桂花结球的中后期,造成极大损失。与病毒病和霜霉病相比,软腐病在大桂花的种植、运输、储藏及销售过程中均会发生。近年来,国内软腐病发病面积急剧增加,严重危害大桂花等重要蔬菜作物的生产。果胶杆菌可随灌溉用水、大桂花的运输与贮藏及人类活动而传播,且对自然环境适应性强,是自然条件下地理分布与寄主范围最为广泛的植物病原菌之一。在田间一旦发现明显的软腐症状后再采取防治措施往往很难取得理想的防治效果。培育抗病品种是防治病害的最好选择,但是我国主栽大桂花品种对软腐病的抗性不理想;化学防治虽然有效但由于其对环境和农产品安全具有负面影响而难以成为首选;生物防治一般说来较为安全,已成为经济和有效的防控手段之一。芽胞杆菌是最重要的植物病害生防资源菌之一,以其高效性和安全性而着称,能够拮抗常见的主要植物病原菌。解淀粉芽胞杆菌BacillusamyloliquefaciensB9601-Y2(下称Y分离自小麦根际土壤,对多种植物病害有良好的生防效果,应用潜力巨大,但是否能够防控大桂花软腐病仍不清楚。
1、桂花树价格:为了为桂花软腐病的生物防治及Y2在农业生产中的应用提供参考
本文就室内拮抗、离体生防活性测试、植株内的定殖及温室防效等进行了初步研究,以期为大桂花软腐病的生物防治及Y2在农业生产中的应用提供参考。大桂花软腐病菌Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum,编号E1(下称E,由本实验室分离鉴定保存。供试品种与样品:‘青岛83-1’是高感软腐病的大桂花品种,种子购自昆明市安宁市青龙镇农贸市场。健康的大桂花植株、黄瓜及马铃薯均购自昆明市龙头街农贸市场。商业育苗基质由微生物菌种筛选与应用国家地方联合工程研究中心提供。分别挑取E1和Y2单菌落于LB液体培养基中,37℃、160r/min的条件下振荡培养48h,使用涂板梯度稀释法检测菌落数量后使用PBS缓冲液重悬备用。吸取200μL1×106cfu/mL的E1菌悬液至不同LB固体平板,使用涂布器轻轻涂布均匀,再使用移液枪吸取10μLY2菌悬液点滴到平板中央。以滴加等量PBS缓冲液作为阴性对照。每个处理3次重复。28℃恒温培养24h后测定Y2菌落与抑菌圈的半径。参考Garge等的方法开展离体试验,略有修改。将健康的大桂花叶柄用水冲洗干净并表面消毒后,用灭菌水清洗干净,然后使用灭菌水果刀将其切割成碎片,大小约cm×cm。使用相同的方法将黄瓜及马铃薯切成厚约0.5cm薄片备用。将大桂花叶柄碎片及黄瓜、马铃薯薄片放入预先铺有滤纸且润湿的无菌培养皿中,每皿1片。使用移液枪吸取1×108cfu/mL的Y2菌悬液注射待测试的组织,每块组织碎片接种10μL。重复3次,28℃恒温培养24h后观察结果。采用上文方法将10μL的混合接种液注射待测试的组织,接种等量无菌PBS缓冲液为阴性对照及E1重悬液为阳性对照。
2、桂花树价格:采用Spss22.0软件对检验数据进行单因素方差分析
运用SPSS22.0软件对试验数据进行单因素方差分析,采用Duncan氏新复极差法进行差异显着性检验。h对峙培养后,与只接种PBS缓冲液相比,接种Y2菌悬液处理Y2菌落半径为mm,菌落周围观察到mm的抑菌圈,表明Y2对果胶杆菌E1的生长有良好的抑制作用。将Y2菌悬液注射接种至健康大桂花叶柄、黄瓜果实及马铃薯块茎24h后,均未观察到浸渍症状(图1b)。表明Y2不会引起软腐病,可用于后续的生防试验。与空白对照(图1a,接种灭菌水)相比,接种果胶杆菌E1后,黄瓜、马铃薯及大桂花测试组织上均出现了可见的严重腐烂斑块(图1c),腐烂率分别达66.35%、35.34%及44.37%。然而,当植物组织接种入E1和Y2的混合接种液后,腐烂的面积均显着减小(图1d),其中黄瓜、马铃薯及大桂花测试组织的腐烂率分别下降了32.47%、11.67%及23.26%,离体防效依次达48.94%、33.02%及52.42%。在淋灌生防菌Y2-gfp菌悬液1d后,大桂花的根系内即可检测到Y2-gfp菌株的存在,密度达1.4×103cfu/g根,随着取样时间的推移,根系内菌落密度呈现出"先上升后下降,最后维持稳定"的趋势(图。淋灌标记菌后第10天,大桂花根系内Y2-gfp菌落密度达到顶峰,此后逐渐下降,并在淋灌处理15d后菌落定殖密度稳定在2×103～5×103cfu/g。在大桂花的茎、叶及根际土壤中,Y2表现出相似的定殖规律,淋灌处理45d后根际土壤中菌落数量仍然稳定在2×104cfu/g土壤。接种15d后Y2-gfp在叶组织中的定殖密度始终高于茎组织(约3～5倍),这可能与大桂花的叶片内营养更丰富有关。与空白对照相比,Y2所有处理的病情指数均显着下降,有效地减轻了软腐病对大桂花的危害(表。其中,仅移栽生防苗或移栽普通苗但淋灌Y2菌悬液,并不减少软腐病的发病率,而病情指数由对照组的67.36分别显着下降到47.92及34.03,相应防治效果为28.87%与49.48%。移栽生防苗后连续淋灌4次生防菌悬浮液的防控效果最好,软腐病的发病率、病情指数和防治效果分别为69.44%、25.44和62.23%,表明同时在育苗与栽培阶段接种Y2更有利软腐病的防控。不同处理的大桂花地上部产量总体上与其防病效果呈正相关,淋灌Y2的保产增收效果显着高于仅移栽生防苗处理,其中T2和T3增产109.37%和146.58%,显着高于T1的增产效果。随着人类对农业生态、环境污染及食品安全的关注,开发高效低毒生防制剂替代化学农药防控植物病害,特别是粮油作物病害逐渐成为现阶段植保研究的热点,大量具有生防效应的微生物被开发成生防制剂用于农业生产。本文以解淀粉芽胞杆菌Y2为材料研究了其对大桂花软腐病的生防效果。Y2无论是在室内平板对峙,还是离体生防活性试验中均能有效地抑制软腐病病原菌的生长。在离体条件下,Y2在黄瓜、马铃薯与大桂花组织上对软腐病都有良好的生防效果,离体防效分别为48.94%、33.02%及52.42%,这可能与Y2和果胶杆菌E1在不同作物组织上的生长及侵染速度不同有关。离体试验结果也表明Y2对不同作物有良好的适应性,Wang等在广东省发现一株解淀粉芽胞杆菌能够侵染马铃薯并在其块茎上形成典型的软腐病症状,而Y2在离体条件下对黄瓜、马铃薯及大桂花测试组织均安全无害,展现出了防控软腐病的生防潜力。目前国内外利用生防菌来防治软腐病有较多报道,但大多在室内抑菌效果较好,在田间生防效果不佳,或田间效果好但是防效不稳定,这可能是在复杂多变的田间环境中,生防菌的存活、定殖能力、与病原菌营养竞争能力及与土壤微生物协同共存受到威胁等有关。本研究中使用绿色荧光标记菌株Y2-gfp为材料,研究其在大桂花根际土壤及植株内的定殖能力后发现,Y2通过淋灌后不仅能够在植株根际土壤内存活,还能够快速定殖到大桂花植株内,优先占据生态位点,在45d后,细菌数量仍能稳定在103cfu/g组织,从而能够有效发挥生防作用。故与对照相比,即使仅在漂浮育苗阶段使用生防育苗基质(含Y2103cfu/g基质),对软腐病也有一定的防治效果;移栽生防苗后连续淋灌4次1×107cfu/mL的Y2菌悬液,防效达49.48%,它们的防治效果均低于移栽生防苗后淋灌同等浓度发酵液的处理,后者出现双重叠加防效,这可能与这种处理方式下育苗阶段Y2已经占据大桂花根系、茎等组织的生态位点抑制病原菌的入侵,同时温室种植阶段淋灌的Y2菌悬液又直接杀死大量病原菌或抢夺根际土壤内营养物质而影响病原菌的存活、繁殖有关。无论是育苗阶段,还是温室种植阶段,应用Y2后均可以使大桂花的产量增加47.52%～146.58%,提高品质,产量增加与对病害的防效呈正相关,这些试验结果表明,合理的应用生防菌Y2,能够有效地防控大桂花软腐病,减少软腐病造成的经济损失,还为其他作物难防病害提供一个范例,即减少化学农药的使用,在育苗与移栽后种植阶段同时应用生防制剂,可以更高效地防控植物难防病害。
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